Nêu các ứng dụng của công nghệ tế bào và công nghệ gen

BÀI TIỂU LUẬNỨng dụng công nghệ tếbào trong chọn tạo giốngcây trồngỨng dụng công nghệ tế bào trongchọn tạo giống cây trồngCông nghệ tế bào thực vật là một trong những côngnghệ quan trọng của công nghệ sinh học, nó là nền tảngđể nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnhvực công nghệ sinh học nông nghiệp. Hiện nay, từ nhữngthành tựu của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tếbào, nuôi cấy hạt phấn và có thể ứng dụng rất nhiều vàolĩnh vực trồng trọt.Vậy công nghệ tế bào là gì?Công nghệ tế bào là phương pháp nuôi cấy té bào hoặcmô trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo ra cơquan hay cơ thể hoàn chỉnh có đầy đủ các tính trạng nhưở cơ thể gốc.-Cơ sở khoa học:Tính toàn năng của tế bào[ totipotency cell]Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.- Công nghệ tế bào bao gồm các kĩ thuật chính: Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro. Kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần Kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi cấy phôiinvitro. Chuyển gen ở thực vật.I-.Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro* Khái niệm:Tạo cây đơn bội in vitro dựa trên cơ sở sinh sảnđơn tính đực là sử dụng hạt phấn [tiểu bào tửtách rời] hay các bao phấn có chứa các hạt phấnđơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạođể kích thích các hạt phấn phát triển thành câyhoàn chỉnh mà không thông qua sự thụ tinh.Hai phương pháp tạo cây đơn bội là:- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.- Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh1.Nuôi cấy bao phấn và hạtphấn• *Khái niệm:• -Là phương pháp dựa trên cơ sở của sựsinh sản đơn tính đực, người ta nuôi cấycác hạt phấn đơn phân[ tiểu bào tử]tách rời hay các bao phấn có chứa cáchạt phấn đơn phân trên môi trường dinhdưỡng nhân tạo phù hợp để kích thíchhạt phấn phát triển thành cây đơn bội.Qui trình:a]Nuôi cấy bao phấn:-Bước 1:Chọn bao phấn: Giai đoạn phát triển của hạtphấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội,tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảmnhiễm lần một.-Bước 2: Xử lí nụ hoa: Xử lí ở nhiệt độ thấp sau khi nụhoa cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để cấy sẽkích thích sự phân chia của tiểu bào tử [hạt phấn đơnnhân] để tạo cây đơn bội.-Bước 3: Chọn môi trường thích hợp.-Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội.Một số phương pháp chọn lọc cây đơn bội:-đếm số lượng NST-đo gián tiếp hàm lượng AND của tế bào,trồng cây táisinh- so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khảnăng sinh trưởng..b]Nuôi cấy hạt phấn:-Các bước tương tự như nuôi cấy bao phấn, tuynhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trướckhi nuôi. Các hạt phấn này được nuôi trongmôi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôicấy trong môi trường bán lỏng.* Ưu điểm và nhược điểm:-Nuôi cấy bao phấn:*Ưu điểm-Vi bao phân có kích thước lớn nên thao tác dễdàng.Môi trường nuôi cấy đơn giản.*Hạn chế:-Khó sàng lọc cây đơn bội-Khi nuôi cấy thường gặp hiện tượng bach tạng.-Kĩ thuật phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổibao phấn,kiểu gen, kinh nghiệm…Nuôi cấy hạt phấn:*Ưu điểm:-Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao.-Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.-Tạo cây đơn bội thuận lợi trong quá trình nghiên cứu ditruyền.- Tạo dòng thuần chủng,tính trạng ỏn định.*Nhược điểm:-Khó thao tác do hạt phấn nhỏ.- Hiệu suất thấp.-Tỉ lệ tái sinh cây thấp.-Kĩ thuật nuôi cấy phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố.-Đối với một số loài cây tạo ra không phải là cây đơn bội.-Ở cây ngũ cốc, chỉ thu được cây xanh rất ít, nhiều câybạch tạng hoặc thể khảm.2.Nuôi cấy noãn chưa thụtinh:*Khái niệm:-Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụtinh được gọi là sự sinh sản đơn tính hay trinhnữ. Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụtinh được hình thành do kích thích tế bàotrứng hay các tế bào cực, tế bào đối cực, tếbào kèm trong noãn phát triển và tái sinh tạothể đơn bội.Qui trình:Noãn chưa thụ tinh →Nuôi cấy invitro→Phátsinh thể giao tử cái→ Hình thành túi phôi→ Tếbào trứng kèm tế bào cực tế bào đối cực→Callus thể tiền phôi →Tái sinh chồi phôi →Tạocây hoàn chỉnh cây đơn bội.Xử lí đa bội hóa→Cây đơn bội kép.Ưu và nhược điểm:*Ưu điểm:-Tỉ lệ tạo cây đơn bội có nhiều khả quan như ởhành và củ cải đường 5-20% ở dâu tằm 3-6%.-Cây tái sinh ít bị bạch tạng .-Các loại cây ngũ cốc ở Việt Nam thì biện phápnày tương đối đơn giản và dễ thành công nhưở cây ngô.*Nhược điểm:-Còn nhiều khó khăn phức tạp do việc tách noãnrất khó và dễ gây tổn thương.-Xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cáirất phức tạp vì túi phôi nằm trong bầu quả.- Còn rất ít nghiên cứu theo hướng này.Ứng dụng chung của phươngpháp này:-Dùng để chọn các cây có dặc tính chống chịuhạn, chịu lạnh, chịu mặn, kháng thuốc diệtcỏ… - Dùng để tạo ra dòng thuần chủng, tính trạngchọn lọc sẽ rất ổn định. Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro đã có nhiềuthành tựu trong việc tạo ra giống cây thuầnchủng tuy nhiên vẫn còn nhiều khó khăn trongviệc lai tạo.II.- Kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần* Khái niệm:- Tế bào trần thực vật [protoplast] là tếbào đã được loại bỏ thành tế bào chỉcòn màng sinh chất bao bọc khối tế bàochất và nhân tế bào.- Dung hợp tế bào trần hay [ lai soma] làsự hợp nhất của các tế bào soma khôngcó thành tế bào của các cá thể hay cácloài khác nhau từ đó tái sinh cây lai từcác tế bào đã dung hợp.Qui trình:Nuôi cấy tế bào trần: Gồm hai giai đoạnGiai đoạn 1:- Nuôi cấy tế bào trần tái sinh thành tế bào vàphân chia tạo cụm nhỏ tế bào:dùng enzimthủy phân thành tế bào. Cho các tế bàotrần vào nuôi cấy trong môi trường nhântạo.Giai đoạn 2:- Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây hoànchỉnh:khi các tế bào trần phát triển thànhkhối mô sẹo[ callus],chuyển khối callus nàysang các môi trường phân hóa chức năng tếbào và nuôi cấy thành cây lai.-Dung hợp tế bào trần: gồm haiphương pháp+ Dung hợp bằng hóa chất+ Dung hợp bằng điện: Đưa dung dịch hỗnhợp tế bào trần[ hai bản cực được thiết kếtrong các hộp dung hợp], các tế bào trầnsẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữahai bản cực. Khi có 1 xung điện cao[ 7501000V] trong một thời gian rất ngắn[ 1200mili giây] vùng tiếp xúc giữa hai màngtế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vàonhau- quá trình dung hợp sẽ xảy ra.Ứng dụng:- Là đối tượng thích hợp nghiên cứu đưa nhân lạpthể, ti thể, AND, Plasmit vào tế bào.-Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạtlai.-Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinhkhối tế bào trong môi trường lỏng.- Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng chonhững cây có giá trị kinh tế cao nhưng khónhân giống bằng phương pháp thông thường.- Công nghệ này làm nhân nhanh giống và kếthợp làm sạch virut. Nghiên cứu tạo giốngkhoai lang kháng bệnh.- Bảo quản nguồn gen.Ưu và nhược điểm:Ưu điểm:- Số lượng cây tạo ra nhiều.-Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh mạnh nhưtế bào thịt lá ở thuốc lá, cải dầu,…bằng kĩ thuật di truyền ởtế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen.-Biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kiathường bị vỏ tế bào ngăn cản.-Tạo nên một thể lai vô tính mà không cần biết chính xác về sựliên hệ giữa các gen.- Ít tốn kém, nhanh, trực tiếp và ít đòi hỏi phương tiện phức tạp.-Từ phương pháp dung hợp tế bào trần mà tạo nên cácphương pháp lai xa giữa các loài.-Tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữutính không thực hiên được.- Có khả năng chống chịu sâu bệnh.Nhược điểm:• Qúa trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện.• Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyểnchọn các sản phẩm phù hợp.• Mới chỉ thành công ở một số loài cây nhưhọ cà solanacea, họ brassiccaceca…còn ởcây ngũ cốc còn hạn chế.• Thường có sự loại bớt NST trong phân bàovà không ổn định.• Trong điều kiện thí nghiệm giữ giống khókhăn.Lai giữa cà chua và khoai tâyNhờ có kĩ thuật nuôi cấy tế bào trầnở thực vật mà người ta đã tạo thành câylai từ hai giống khác nhau khá xa về mặtdi truyền tạo nên những giống cây lai cógiá trị kinh tế cao. Tuy nhiên kĩ thuật nàychỉ mới thành công nhất là ở cây lúanhưng vẫn còn nhiều hạn chế ở cácgiống thuộc loài phụ.Japoni a, còn cácgiống lúa thuộc dưới chi Indica vẫn khótái sinh thành công và trong số cây táisinh được tỉ lệ bất thụ cao.III- Kĩ thuật thụ phấn trongống nghiệm và nuôi cấy phôiinvitro*Khái niệm:-Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ phấntrong ống nghiệm không phụ thuộc vào cơ thểmẹ.Nuôi cấy phôi [cứu phôi] là sự tách rời và nuôicấy invitro phôi hợp tử đã thành thục hoặcchưa thành thục thành cây hoàn chỉnh.

Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh họcI. KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌCCó nhiều định nghĩa và cách diễn đạt khác nhau về công nghệ sinh học tùy theotừng tác giả, nhưng tất cả đều thống nhất về khái niệm cơ bản sau đây: Công nghệsinh học là quá trình sản xuất các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tốtham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống [vi sinh vật, thực vật, động vật].Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xemnhư một lò phản ứng nhỏ.Đầu những năm 1980, đã bắt đầu hình thành công nghệ sinh học hiện đại làlĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học của các tế bào đã được biến đổi ditruyền. Công nghệ sinh học hiện đại ra đời cùng với sự xuất hiện kỹ thuật gen. Cơ sởsinh học được áp dụng ở đây bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học,di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, cùng các nguyên lý kỹ thuật máy tính...Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học một cách tổng quát nhất:- Do UNESCO [1985] định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộphận hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng.- Do Trường Luật Stanford [1995] định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệchuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm vàchức năng của gen đó.Sự khác biệt rõ rệt nhất của hai định nghĩa trên thuộc về đối tượng tác động củacông nghệ sinh học: UNESCO xem cơ quan, bộ phận, tế bào và chức năng riêng rẽcủa sinh vật là đối tượng, trong khi đó Trường Luật Stanford lại coi gen là đối tượngtác động của công nghệ. Từ các định nghĩa trên, có thể phân biệt được hai nhóm côngnghệ sinh học là:1. Công nghệ sinh học truyền thống [traditional biotechnology]Bao gồm:+ Thực phẩm lên men truyền thống [food of traditional fermentations]+ Công nghệ lên men vi sinh vật [microbial fermentation technology]+ Sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu vi sinh vật [production of microbial fertilizerand pesticide]+ Sản xuất sinh khối giàu protein [protein-rich biomass production]+ Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật [plant micropropagation]+ Thụ tinh nhân tạo [in vitro fertilization]2. Công nghệ sinh học hiện đại [modern biotechnology]Bao gồm:+ Nghiên cứu genome [genomics]+ Nghiên cứu proteome [proteomics]+ Thực vật và động vật chuyển gen [transgenic animal and plant]+ Động vật nhân bản [animal cloning]1+ Chip DNA [DNA chip]+ Liệu pháp tế bào và gen [gene and cell therapy]+ Protein biệt dược [therapeutic protein]+ Tin sinh học [bioinformatics]+ Công nghệ sinh học nano [nanobiotechnology]+ Hoạt chất sinh học [bioactive compounds].II. KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀOCông nghệ tế bào là một bộ phận quan trọng của công nghệ sinh học, chủ yếunghiên cứu các quá trình nuôi cấy tế bào động - thực vật và vi sinh vật để sản xuấtsinh khối, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học [enzyme, vaccine, các chất thứcấp…].Mặc dù, các kỹ thuật nuôi cấy tế bào chỉ được phát triển vào nửa đầu thế kỷ 20,nhưng đến nay các ứng dụng của chúng đã có những bước tiến vượt bậc nhờ sự đónggóp của công nghệ DNA tái tổ hợp.Công nghệ tế bào bao gồm:- Công nghệ tế bào thực vật.- Công nghệ tế bào động vật.- Công nghệ tế bào vi sinh vật.III. VAI TRÒ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC1. Công nghệ tế bào trong công nghệ gen1.1. Cơ sở khoa học của công nghệ gen Dựa vào đặc điểm hoạt động của gen- Gen mã hóa protein theo mã bộ ba  biểu hiện tính trạng.+ Thay đổi gen  thay đổi tính trạng.+ Sử dụng gen để biểu hiện  sản xuất các chế phẩm.- Gen là một đoạn của ADN+ Có thể cắt rời nhờ enzim cắt liêt kết phosphodiester [RE].+ Gen là một thực thể có thể hoạt động độc lập.+ Có khả năng di chuyển vào tế bào lạ nhờ công cụ.- Hoạt động của gen+ Gen chuyển vào tế bào lạ  gen biểu hiện được và hệ gen tế bào lạ không bị ảnhhưởng. Dựa vào tính toàn năng của tế bàoMột tế bào đã chuyên hóa chứa một lượng thông tin di truyền [bộ ADN] tươngđương với một cơ thể trưởng thành, để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể pháttriển thành một cơ thể hoàn chỉnh.21.3. Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ genTùy vào đối tượng nhận gen là tế bào thực vật, tế bào động vật hay vi sinh vậtmà vai trò của công nghệ tế bào thể hiện khác nhau.Trong công nghệ gen vai trò của công nghệ tế bào thể hiện ở khâu nuôi cấy tếbào.1.3.1. Nuôi cấy tế bào thực vậtSau khi thực hiện các bước của quá trình chuyển gen: xác định gen liên quanđến tính trạng cần quan tâm; phân lập gen [PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặctừ thư viện genomic DNA]; gắn gen vào vector biểu hiện [expression vector] để biếnnạp; biến nạp vào E. coli; tách chiết DNA plasmid; thì biến nạp vào mô hoặc tế bàothực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau. Chẳng hạn sử dụng phươngpháp xung điện, ở đây tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này cóthể làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đivào bên trong tế bào. Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme phân giải và đểcho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo nên. Các tế bào biến nạp này đượcnuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinhtrưởng để tạo nên cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genomenhư PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những câybiến đổi gen.Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện, hiện naycó hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA vào trong tế bào.Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ người ta có thể đưa cácphân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp. Phương pháp nàyđầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động vật, nhưng sau này người ta đã sử dụng chotế bào thực vật. Phương pháp thứ hai là bắn vào tế bào các vi đạn [microprojectile],thường bằng vàng hoặc wolfram, được bao bọc bởi DNA. Phương pháp này được gọilà phi sinh học và được sử dụng thành công ở nhiều loại tế bào khác nhau.Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biếnnạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàngbằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loạicỏ khác cũng gặp một vài khó khăn. Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thểtạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tụcchuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt.1.3.2. Nuôi cấy tế bào động vậtCông nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loàikhác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau:tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật;tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy3truyền hợp tử [đối với động vật bậc cao]; phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểuhiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuấtđộng vật chuyển gen.Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để pháttriển đến giai đoạn phôi dâu [morula] hoặc túi phôi [blastocyst]. Ở giai đoạn này màngtrong [pellucida] bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi nàyđược cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả [pseudopregnant] để phát triểnthành cá thể con.Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này. Tuy nhiên ở cá,trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp [chorion] dày lên, rất dai và dính gây trở ngại choviệc định vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNAvào trứng. Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêmđòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác. Ðể khắc phục các nhược điểm này, người tacó thể tiến hành loại màng thứ cấp, kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạophôi trần để tạo cá bột.Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phảiSơ đồđượctạo độngkiểm tra xem gen lạ cóHìnhxâm2:nhậpvào vậtbộ chuyểnmáy digentruyền của động vật trưởngthành hay không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không.Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn[Southern blot, Northern blot...] hoặc PCR.Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiênmã và dịch mã. Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sảnphẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuậtmiễn dịch phóng xạ [RIA] để phát hiện protein lạ trong động vật.Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen [F1, F2, F3, ...] để xác định gen lạ códi truyền hay không.Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạovà chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen.1.3.3. Nuôi cấy tế bào vi sinh vậtSự sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng nhân tạođược gọi là nuôi cấy [cultivation]. Một kiểu nuôi cấy chỉ chứa một loại vi sinh vậtđược gọi là nuôi cấy thuần khiết [pure culture]. Nuôi cấy hỗn hợp [mixed culture] làmột loại nuôi cấy chứa nhiều hơn một loại vi sinh vật.Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật như sau:- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho phép vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt nhất.- Khử trùng môi trường để loại bỏ tất cả các cơ thể sống có trong bình nuôi cấy.- Cấy vi sinh vật vào trong môi trường đã chuẩn bị.4Để nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nuôi cấy phải được chuẩn bị trong nhữngloại bình nuôi được sử dụng phổ biến nhất, chẳng hạn ống nghiệm, bình tam giác, đĩapetri hoặc nồi lên men. Có hai loại môi trường nuôi cấy chính: môi trường tự nhiên[dựa trên kinh nghiệm] và môi trường tổng hợp [thành phần hóa học xác định]. Nóichung, các môi trường dinh dưỡng rất khác nhau về hình thái [dạng rắn hoặc lỏng] vàthành phần, tùy thuộc vào loại vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôi cấy.Môi trường sau đó phải được khử trùng để loại bỏ tất cả các cơ thể sống trongbình chứa môi trường. Phương pháp khử trùng phổ biến nhất là khử trùng bằng hơinước dưới áp suất cao trong nồi khử trùng [autoclave].Tiếp mẫu [vi sinh vật] vào bình chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng. Sự tiếpmẫu khi nuôi cấy trên môi trường rắn có agar được thực hiện bằng que cấy có vòngkim loại ở đầu [metal wire hoặc loop] được khử trùng nhanh trước khi sử dụng bằngcách đốt nóng trên đèn cồn.Cấy chuyển trong nuôi cấy lỏng thường được thực hiện bằng Pasteur pipette.Sự tiếp mẫu thường được tiến hành trong tủ cấy vô trùng [laminar flow cabinet] đểgiảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn.Ví dụ: Người ta đã chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin của ngườisang cho E. coli. Vi khuẩn E. coli tái tổ hợp gen được nuôi cấy trong nồi lên men códung tích 1.000 L, sau một thời gian ngắn có thể thu được 200g insulin, tương đươngvới lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 con bò.2. Công nghệ tế bào2.1. Công nghệ tế bào thực vật2.1.1. Nuôi cấy mô tế bàoa. Cơ sở khoa học- Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.- Khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật.- Sự sinh trưởng của tế bào thực vật.- Vai trò của chất điềuhòavậtsinh trưởngMẫub. Quy trìnhKhử trùngNuôi cấy ban đầu[Tạo callus]Tạo phôiTạo hạt nhân tạo5Tạo chồiTạo rễTạo cây Chuẩn bị mẫu vật- Chọn mẫu vật có khả năng nuôi cấy tốt.- Thu hái mẫu vật.- Khử trùng sơ bộ: bằng cồn 700C- Khử trùng tuyệt đối: HgCl2 0,1% Chuẩn bị môi trườngMặc dù nhu cầu dinh dưỡng của các loại mô nuôi cấy là rất khác nhau nhưngmôi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa các thành phần sau:- Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium,phosphorus, magnesium và sulfur. Đây là sáu nguyên tố chính cần thiết cho sinhtrưởng của thực vật bậc cao.- Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron,copper, molybdenum và cobalt ở dạng vết.- Các phụ gia hữu cơ: Một lượng nhỏ các loại vitamin [myo-inositol, thiamine,nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…], các amino acid [thường cho phép bỏ quanhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng], và các phụ gia hữu cơ khôngxác định khác [malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa…].- Các chất kích thích sinh trưởng thực vật: Thành phần phụ gia quan trọng nhất quyếtđịnh kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinhtrưởng. Các auxin [IAA2 và các dạngtương tự được tổng hợp nhân tạo như 2,4-D3, NAA4, IBA5, NOA6…], và cáccytokinin [zeatin, 2i-P7 và các dạng tương tự được tổng hợp nhân tạo như kinetin,BA8…] là những nhóm chất kích thích sinh trưởng và phát sinh hình thái chủ yếutrong nuôi cấy mô và cơ quan của thực vật.- Nguồn carbon: Thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbonđược thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp. Trong đa số các thí nghiệm nuôicấy, tế bào thực vật đã mất khả năng quang hợp. Glucose cũng thường được đưa vàomôi trường và cho hiệu quả tương đương sucrose, trong khi fructose cho hiệu quả kémhơn.- Các tác nhân làm rắn [tạo gel] môi trường: Thường sử dụng là agar, một loạipolysaccharide thu được từ một số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ [Rhodophyta]. Một sốhợp chất khác cũng được thử nghiệm thành công như alginate, phytagel, methacel vàgel-rite.6 Nuôi cấy ban đầuMôi trường MS + 30g/l agar + 30g/l saccharose + 1-3 ppm 2,4 D. Thực hiện quá trình phản phân hóa tạo callus Nhân nhanh callusMôi trường MS + 1-2ppm 2,4 D + 1-2 ppm BAP  Tăng số lượng callus Tạo phôiMôi trường MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 1-5ppm 2,4 D; 1-2ppm BA; 12ppm NAA;  Tạo phôi để nuôi cấy thành cây Sản xuất hạt nhân tạo Tạo chồiMôi trường MS + Kinetin + BAP + Zeatin [1-3ppm]  Tạo chồi từ callus. Tạo rễ- Môi trường MS + NAA, TAA, PAA [1-3 ppm].- Rễ tạo ra từ callus. Nuôi cấy tạo cây conNuôi cấy tiếp trong môi trường tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh. Đưa ra vườn ươm.c. Thành tựuTạo ra hàng loạt bản sao của một cây ưu việt hay là nhân nhanh cây trồng quymô công nghiệp. Đây là nền tảng của công nghệ vi nhân giống.Ví du: Atiso, măng tây, củ cải đường, tỏi, gừng, khoai tây, Raspberry, dâu tây, míađường, khoai lang, khoai nước, dứa dại, hạnh nhân, táo tây, chuối, cam, chanh, dừa,anh đào, kiwi, cọ dầu, đu đủ, lê, dứa, chuối bột, nho, hạt dẻ, tre, lim, bạch đàn, vả,cẩm chướng, cúc,Iris, Gerbera, huệ, lan, Pelagonium, đỗ quyên, hoa hồng, …Một số cây đang được tái sinh trong phòng thí nghiệm: cây bơ, ca cao, cà phê,Jojoba, cao su, chà là, thuốc lá, cà rốt, Endive, cải dầu, ngô, đậu, củ từ, đậu nành,[theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987].Trong cải tạo giống nhiều khi tạo ra được giống có năng suất cao và chống chịugiỏi nhưng lại không có hạt hoặc rất ít hạt để có thể gieo trồng lại. Bằng phương phápnói trên, người ta có thể sản xuất hạt nhân tạo bằng các tế bào bình thường của câynày với một lượng lớn. Trên thị trường thế giới có bán nhiều hạt nhân tạo với các tínhưu việt nói trên, trong đó có hạt lúa mì, hạt lúa, táo,…2.1.2. Công nghệ tế bào trầna. Cơ sở khoa học- Tế bào thực vật có màng cellulose- Các cơ sở của công nghệ nuôi cấy mô tế bào- Dựa vào đặc điểm lai tế bào soma7+ Nhân lai + tế bào chất lai  cây lai+ Nhân lai + tế bào chất không lai+ Nhân không lai + Tế bào chất lai+ Nhân không lai + tế bào chất không laib. Quy trình Tạo mẫu vật- Chọn nguyên liệuThường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt.Vì lá cây là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplastthực vật, dễ phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất.Lấy lá từ những cây không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ. Cũng có thể táchtế bào trần từ mô sẹo, bao phấn.- Xử lý sơ bộ: Các tế bào được ngâm trong dung dịch là ổn định áp suất thẩm thấu.Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12 – 14% để duy trì tính ổn định của màngsinh chất. Xử lý enzim thủy phân tạo tế bào trầnDùng enzim pectinase, hemicellulase, cellulase để phá vỡ thành tế bào. Có thểdùng riêng lẻ hoặc kết hợp tùy vào từng loại tế bào Tách tế bào trần- Xác định xem còn thành tế bào hay không: Dùng calcofour để xác định. Calcofourbám vào các phân tử cellulose và phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh rực rỡ khi soidưới tia cực tím. Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi thườngcó màu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánhsáng huỳnh quang đỏ của lạp thể.- Xác định khả năng sống sót của tế bào trần: tế bào chất của những tế bào xuất hiện ởdạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinhchất là những tế bào sống. Ngược lại những tế bào chết.- Xác định sức sống của tế bào trần: Trộn 2ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10ml môitrường tách tế bào trần. Lấy 0,25ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1ml hỗn hợpdịch nhuộm trên, để trong 15 phút. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không chothuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinhchất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được. Nuôi cấy trong môi trường đẳng trươngc. Thành tựuCông nghệ tế bào trần có vai trò quan trọng trong tạo giống mới.Ngày nay người ta đang sử dụng kĩ thuật dung hợp protoplast để tạo ra nhữngcây lai mới. Chẳng hạn, lai khoai tây trồng và khoai tây hoang dại. Gene cây hoang8dại giúp cây trồng chống bệnh virus.. Người ta lai cây cà chua với cây khoai tây [họhàng chúng xa nhau] cho cây lai mang quả cà chua và củ khoai tây.Bằng cách này, người ta tạo ra cây lai giữa cà rốt và rau mùi, cam và chanh, …Đối với cọ dầu, từ protoplast và sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp gene có thể nângcao hiệu quả, chọn lọc các dòng có dầu có năng suất cao. Đối với mía, dung hợpprotoplast có ý nghĩa lớn đối với việc phổ biến các giống mía không ra hoa [trốn cờ]hoặc bất thụ. Các kết quả nghiên cứu của CENA [Centre de Nuclear Energy inAgriculture] và CEBTEC [Divis.o de Biotechnology de Plantas et Centro deBiotechnologia Agricola] ở Brazil cho thấy, dung hợp protoplast cây mía có thể giúpchuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dòng mía này qua dòng mía khác.Dung hợp protoplast có thể chọn giúp các dòng cà phê kháng bệnh và các độctố do nấm tiết ra để đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm chọn ra các dòng tế bào khángđộc tố cho cà phê. Năm 1987, ở Costa Rica cũng đã tái sinh cây cà phê từ protoplastđược tách từ phôi vô tính hình thành từ huyền phù tế bào callus lá. Sau khi nuôi cấyprotoplast vài lần trên môi trường chứa 0,5 mg/l kinetine, 0,5 mg/l 2,4D. 0,5 mg/lNAA, các tác giả thu được callus nhỏ. Khi cấy chuyền sang môi trường không có chấtsinh trưởng các callus phát triển thành phôi và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Ngườita cũng dung hợp protoplast cao su từ các tế bào phôi vô tính. Đến nay đã có hơn 70loài cây cũng được sinh ra từ protoplast.Khi dung hợp protoplast, người ta còn tạo ra được giống lai giữa tế bào thựcvật và vi khuẩn. Sự dung hợp protoplast giữa tế bào tảo lam [vừa,có đặc tính quanghợp vừa có đặc tính cố định N2 trong không khí] với callus thực vật làm kích thích sựphát triển của chúng.Cũng với kĩ thuật trên, người ta có thể dung hợp được các tế bào soma với tếbào sinh dục [hạt phấn] để tạo ra cây lai giữa các họ với nhau.Tóm lại, kĩ thuật dung hợp protoplast hiện tại đang mở ra một khả năng rộnglớn trong việc tạo ta những giống có thể tập hợp được nhiều đặc tính tốt từ các câykhác nhau.Hơn nữa, nhờ việc tạo thành protoplast, nó trở thành công cụ nghiên cứu cácquá trình sinh hóa, đặc biệt là acid nucleic và protein trong tế bào, dùng mô hìnhnghiên cứu di truyền phân tử, nghiên cứu sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào,nghiên cứu quá trình cộng sinh vi khuẩn trong cây bộ Đậu, nghiên cứu các enzyme,nghiên cứu cơ chế của quá trình quang hợp v.v. làm cơ sở khoa học cho việc nghiêncứu ứng dụng phục vụ cho đời sống của con người.2.2. Công nghệ tế bào động vật2.2.1. Chuyển phôi tạo giống vật nuôia. Cơ sở khoa học- Dựa vào đặc điểm sinh sản của động vật9+ Động dục+ Quá trình thụ tinh+ Quá trình nuôi thai- Dựa vào quá trình phát triển phôi động vật+ Các giai đoạn phát triển.+ Môi trường phát triển- Đặc điểm của tế bào động vật.b. Quy trình- Xử lý con cái cho phôi.+ Thực hiện quá trình thụ tinh+ Cung cấp phôi.- Xử lý phôi+ Tách phôi+ Chuyển gen- Xử lý con vật cái mang phôic. Thành tựuPhương pháp chuyển phôi được sử dụng để tăng khả năng sinh sản của độngvật cái. Hiện nay đây là phương pháp phổ biến được sử dụng trong thực tiễn chọngiống gia súc [trâu, bò, cừu, lợn, dê,..] ở nhiều nước trên thế giới.2.2.2. Nuôi cấy tế bào động vậta. Quy trìnhChọn tế bào nuôi cấy- Dựa vào mục đích để chọn tế bào nuôi cấy- Chọn tế bào có độ tuổi thích hợp [thường là tế bào ở độ tuổi còn non].Chuẩn bị môi trườngMôi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các aminoacid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose.Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% [theo thể tích] huyết tương củađộng vật có vú. Môi trường Eagle [Eagle 1959], đây là một trong những môi trườngđược sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào động vật [Hình10]Nuôi cấy tế bàoNuôi cấy trong bể nuôi cấy tế bào động vật. Phương pháp chính trong nuôi cấytế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấydịch huyền phù trong hệ lên men. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vậtkhó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong cácloại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tếbào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm10Hình 10: Thành phần môi trường Eagle [1959].men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó,các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù cómột số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tếbào động vật ít nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau nhưBHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theophương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine vàcác sản phẩm khác.Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằngcách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí trực tiếp cóthể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tánthông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây rahiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cungcấp thêm oxygen.Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm dokhông tạo ra bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng.Thu nhận chế phẩm- Tách chiết thành phần mong muốn từ tế bào.- Tạo chế phẩm.b. Thành tựu2.2.3. Nhân bản vô tính động vật2.2.4. Công nghệ tế bào gốc, tế bào mầmTế bào gốc là loại tế bào chuyên biệt hoá, có nhiều tiềm năng – có thể biếnthành nhiều loại tế bào khác. Phân biệt tế bào gốc phôi, từ thai và từ cơ thể trưởngthành. Thường ở giai đoạn phôi thì nó có nhiều. Những thành tựu khoa học mới đâynhất đã cho thấy, từ cơ thể trưởng thành chúng ta đã có thể tách thành các tế bào gốcvà từ đó có thể chuyển hoá thành nhiều loại tế bào khác.Cụ thể, là từ tế bào da của người trưởng thành chuyển hoá thành các tế bào gốc,thông qua phương pháp chuyển-mở một số gen trong nhân tế bào, và làm cho chúngtrở thành dạng sơ khai, dạng gốc ban đầu. Việc này đưa lại nhiều triển vọng rất lớntrong trị liệu, ví như khi cơ thể của một ai đó bị thoái hoá các cơ tim chẳng hạn, thìngười ta lấy tế bào gốc của chính người đó để chuyển hoá thành tế bào cơ tim và nuôidưỡng chúng thành các cơ tim rồi làm các thủ thuật thay thế.Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã tạo ra được tế bào gốc từ nhiều loại tếbào khác nhau, từ phôi, thai, từ tế bào máu, từ tế bào âm đạo, và gần đây là từ tế bàoda của người trưởng thành. Và từ tế bào gốc, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứuthành công việc chuyển hoá chúng thành các loại tế bào, các loại mô, cơ khác nhau11của cơ thể như tế bào thần kinh, tế bào máu, cơ tim, giác mạc mắt v.v… Với tế bàogốc từ cuống dây rốn, người ra đã có thể chữa được một vài bệnh liệt, tuỷ sống,bỏng…3. Công nghệ tế bào trong công nghệ protein – enzim3.1. Cơ sở khoa học công nghệ protein – enzim- Dựa vào tính chất kết tủa, hòa tan của protein.VD: Môi trường [NH4]2SO4 bán bão hòa globulin kết tủa+ Các protein khác nhau kết tủa ở pH khác nhau+ Protein kết tủa tại điểm đẳng điện khác nhau- Dựa vào sự tích điện của các protein khác nhau  tốc độ chạy điện trong điện dikhác nhau- Dựa vào tốc độ chạy qua cột sắc ký khác nhau của các protein khác nhau.3.2. Quy trình- Tách protein tổng số từ tế bào+ Phá hủy màng tế bào+ Tách protein tổng số từ hỗn hợp các hóa chất từ hợp chất hữu cơ của tế bào sử dụngtác nhân kết tủa chung.+ Tách protein kết tủa bằng phương pháp lọc.- Tách riêng loại protein cần+ Sử dụng các tác nhân kết tủa riêng biệt+ Tách riêng protein bằng phương pháp lọcVai trò của công nghệ tế bào trong công nghệ protein – enzim thể hiện ở giaiđoạn tách protein tổng số từ tế bào.Phá vỡ tế bàoProtein enzim có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Saukhi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong môi trường các dịchcơ thể, dịch môi trường [gọi là protein enzim ngoại bào] hoặc được giữ lại bên trongtế bào [protein enzim nội bào]. Các protein enzim nội bào có thể tồn tại ở dạng hòatan trong tế bào chất và các bào quan nhân của tế bào. Do đó để chiết rút các proteinenzim nội bào phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào chứa chúng và chuyển vào dungdịch.Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như: nghiền với bộtthủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiền đồng thể. Để việc phávỡ có hiệu quả, ở mô thực vật trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vàongăn đá hoặc cho trương nước. Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khichiết protein enzim người ta cần cắt bỏ các mô liên kết.12Muốn tách được protein trong các cơ quan tử, người ta còn phải dùng các yếutố vật lý và hóa học khác như: sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol,aceton, glycerin, ethylacetat,….Chiết rút proteinSau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất protein enzimbằng các dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối vớiprotein enzim nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzim ngoạibào. Việc chọn phương pháp tách chiết protein enzim tùy thuộc vào tính chất proteinenzim cần nghiên cứu3.3. Thành tựuProtein enzim được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất bia.- Amylase dùng trong sản xuất đường mật ngô và chocolate, trong sản xuất bia, chếbiến dextrin với dịch đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ em, trong sảnxuất nước quả và trong y học.- Protease thủy phân protein của sữa để chế biến những món ăn kiêng đặc biệt, đượcdùng trong thuộc da, sản xuất bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len dạ và trong y học.Protease vi sinh vật có thể sử dụng cùng với amylase trong chế biến thức ăn gia súc.- Pectinase là nhóm enzyme thủy phân pectin tạo thành galacturonic acid, glucose,galactose, arabinose, methanol…- Cytolase là hệ enzyme có hoạt tính cao có thể phân hủy hemicellulose, pentozan,lignin… Các enzyme này được gọi chung là cytolase [bao gồm cellulase,hemicelllulase, pentosinase].- Invertase là enzyme nội bào được dùng rộng rãi trong sản xuất bánh kẹo, rượu mùi,kem, mật ong nhân tạo. Nó làm tăng vị ngọt khi thủy phân đường saccharose thànhfructose và glucose, làm tăng độ hòa tan của saccharose trong sản phẩm.Trong một tương lai gần, enzyme sẽ được sử dụng rộng rãi trong y học để làmđầu dò [probe] cho các thiết bị phân tích y khoa và để chữa bệnh. Hiện nay, một sốenzyme như: glucooxydase, hexokinase, esterase, urease, cholesteroloxydase,alcoholdehydrogenase… đã được sử dụng khá phổ biến trong y học. Điển hình nhất làsử dụng glucooxydase cố định trên bề mặt điện cực platinum trong thiết bị phân tíchhàm lượng glucose máu. Trong y học, enzyme còn được sử dụng để chữa trị một sốbệnh liên quan đến sự thiếu hụt của một số enzyme trong cơ thể người, hoặc dùngenzyme để loại bỏ những cục thịt, mỡ dư thừa gây nguy hiểm cho một số bộ phận củacơ thể người. Chẳng hạn: dùng enzyme streptokinase và urokinase để làm tan máuđông làm tắc nghẽn mạch máu.13