Quy trình thực hiện phương pháp đếm khuẩn lạc

Quy trình định lượng Enterobacteriaeae bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .1. phạm vi ấp dụngTheo TCVN 5518-2:2007 quy định phương pháp Enterobacteriaeae màkhông cần phải qua giai đoạn tiền tăng sinh.Phương pháp này áp dụng cho:-Các sản phẩm thực phẩm chăn nuôiCác mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm .Việc định lượng được thực hiện bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môitrường đặc sau khi ủ ấm ở 37 độ C [hoặc 30 độ C ]. Khi số lượng khuẩn lạc dựkiến có mặt nhiều hơn 100 trong một mililit hoặc một gam mẫu thử ,thì nêndùng kỹ thuật này.2.Nguyên tắc-Vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc đặc trưng trên thạch glucoza mật đỏ tím vàlên men oxidaza âm tính .3.Mơi trường và hóa chấta, SPW[Saline Peptine Water]Pepton từ casein1,0 gNatriclorua8,5 gNước1 000 ml-Chuẩn bịHòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.-Mục đích : pha lỗng mẫu-b, VRBG[Violet Red Bile Glucose ]Thành phần :Dịch thủy phân mô động vậtbằng enzymCao nấm menMuối mật NO3Glucoza7,0 g3,0 g1,5 g10,0 g Natri cloruaĐỏ trung tínhTím tinh thể [crystal violet]ThạchNước5,0 g0,03 g0,002 g[9 -18]g1000 ml- Chuẩn bịHòa tan các thành phần hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ trong nước bằng cáchđun sơi.Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi là 7,4 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.Phân phối môi trường nuôi cấy này vào các ống nghiệm hoặc bình vơ trùng[6.5] có dung tích khơng lớn hơn 500 ml.Khơng khử trùng mơi trường.Chuẩn bị môi trường này ngay trước khi sử dụng. Mơi trường nấu chảy đượcdùng trong vịng 4 h.-Mục đích: Nuôi cấy Enterobacteriaeae.c, NA/TSA.-Thành phần :Cao thịtDịch thủy phân mô dungdịch bằng enzymNatri cloruaThạchNước3,0g5,0g5,0g[9-10]g1000 mlChuẩn bịHòa tan các thành phần hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ trong nước bằng cách đunnóng, nếu cần.Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.Phân phối môi trường ni cấy vào các ống nghiệm hoặc bình vơ trùng[6.5] có dung tích khơng lớn hơn 500 ml. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực [6.1] ở 121oC.-Mục đích :phục hồid, Thạch glucoza-Thành phần :Dịch thủy phân casein bằngenzymCao nấm menGlucozaNatri cloruaBromcresol tíaThạchNước10,0 g1,5 g10,0g5,0g0.015g[ 9-18 ]g1000mlChuẩn bịHịa tan các thành phần hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ trong nước bằngcách đun nóng, nếu cần.Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.Phân phối môi trường nuôi cấy vào các ống nghiệm hoặc bình cầu vơtrùng [6.5] có dung tích thích hợp.Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực [6.1] ở 121oC. Để các ống theophương thẳng đứng.Môi trường này có thể bảo quản đến 1 tuần ở 5 oC ± 3 oC.Ngay trước khi sử dụng, làm nóng mơi trường trong nước sơi hoặc luồnghơi nước trong 15 min, sau đó nhanh chóng làm nguội đến nhiệt độ ủ ấm.-Mục đích :khẳng định Enterobacteriaeaee, thuốc thử oxidaza-Thành phần:N,N,N’N’-Tetrametyl-phenolendiamin-1,0g dihydrocloruaNước100mlChuẩn bịHòa tan thành phần trên trong nước lạnh.Chuẩn bị thuốc thử ngay trước khi sử dụng.Có thể sử dụng các đĩa hoặc que thử có bán sẵn. Trong trường hợp này,cần theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.-Mục đích : khẳng định Enterobacterieaea. 4. Quy trình phân tích10g đối với mẫu rắn hoặc 10ml đối với mẫu lỏng + 90ml Saline PeptoneWater[ SPW]Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giâyDịch mẫu 10-2Dịch mẫu 10-115ml15ml2 đĩaVRBG2 đĩa[VRBG đã đun chảy và làmnguội đến 370C]Xoay nhẹ trộn đều mẫu ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lậtngược đĩa và ủ ấm 37oC trong 24hĐọc kết quảChọn các đĩa mọc ≦ 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha lỗng liên tiếpKhẳng định sinh hóa:thạch glucoza vàoxidaseTính và biểu thị kết quả 4.1. pha loãng mẫu .- Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.- Từ mẫu thử chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thậpphân tiếp theo.→ Làm giảm mật độ vi sinh vật trong mẫu đến ngưỡng có thể đém được.4.2. Phân lập--Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyềnphù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác, vào hai đĩa Petri [dùng kỹ thuật đổ đĩa]chứa thạch glucoza mật đỏ tím. Phủ lên trên bằng một lớp mơi trường thạchnày.Chuẩn bị các cặp đĩa thạch khác trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịchpha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.Ủ các đĩa thạch này ở 37oC [hoặc 30oC] trong 24 h ± 2 h.→ nhằm tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu để khảo sát .khi vi khuẩntăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra các khuẩn lạcmang tính đặc trưng .4.3. Khẳng địnhCác khuẩn lạc Enterobacteriaceae giả định được cấy truyền lên môi trườngkhông chọn lọc và khẳng định bằng các phép thử lên men glucoza và kiểm trasự có mặt của oxidaza→4.4. Tính tốnTính số lượng Enterobacteriaceae có trong một mililit hoặc trong một gammẫu thử từ số lượng khuẩn lạc điển hình đã khẳng định trên mỗi đĩa.→ Giúp cho việc đánh gia mẫu đạt chuẩn hay không

Khuẩn lạc của một loại vi khuẩn được định nghĩa là một cụm [Colony], có thể nhìn thấy được bằng mắt thường, sinh khối của vi khuẩn đó khi chúng phát triển trên bề mặt của một giá thể cứng.

Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU [viết tắt từ chữ Colony form units]  là đơn vị được dùng để ước tính số lượng vi khuẩn hoặc tế bào nấm trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định.
Khi kiểm tra vi sinh vật trong một mẫu thử nghiệm bằng cách đếm khuẩn lạc có trên đĩa petri hoặc đĩa môi trường chuẩn bị sẵn [ví dụ đĩa Compact Dry], đơn vị thể hiện khuẩn lạc thường là CFU/mL, CFU/g, CFU/25g.

• Đơn vị CFU/g , CFU/25g thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn [thực phẩm, nguyên liệu thực phẩm…]
• Đơn vị CFU/mL dùng cho mẫu thử nghiệm ở dạng dung dịch như mẫu nước nuôi trồng thủy sản, nước trái cây…

MPN  là viết tắt của Most Probable Number, nghĩa là số có xác xuất lớn nhất. MPN thường được dùng để biểu thị số lượng vi khuẩn có trong một thể tích nhất định của mẫu chất lỏng.

• CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc có trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định. CFU thường được tính từ phương pháp đổ đĩa hoặc cấy trang trong khi đó MPN thường được tính toán bằng phương pháp lên men. Đối với CFU, vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc [ví dụ như thạch], sau đó, các khuẩn lạc được đếm thủ công bằng mắt hoặc ứng dụng hiện đại.
• Đối với phép đo MPN, các mẫu được nuôi cấy trong môi trường lỏng, [ví dụ như lên men]. Kết quả không dùng phương thức đếm mà là so sánh với bảng xác xuất.
• MPN và CFU tương đương nhau. Cả hai đều được công nhận bởi nhiều tổ chức quản lý và khoa học trên thế giới, trong đó có cả Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ [EPA] và Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế [ISO].

Với phương thức đếm khuẩn lạc thủ công, mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi khuẩn đích được đếm một lần. Để dễ kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên một lưới ô. Sau đó đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô và đánh dấu khuẩn lạc đếm được ở đằng sau của đĩa petri. Để đảm bảo chính xác, mỗi mẫu thử nghiệm cần được nuôi cấy ít nhất 3 đĩa và lượng khuẩn lạc thích hợp cho đếm thủ công là 30 tới 300 khuẩn lạc. Các đĩa có quá nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều không thích hợp và cần pha loãng và cấy lại mẫu.

Đếm khuẩn lạc thủ công thường mất rất nhiều thời gian và có thể mắc phải sai số chủ quan của người đếm. Để cải thiện tình trạng này, hiện nay các phòng lab đã trang bị thêm các thiết bị đếm khuẩn lạc tự động.
Nguyên lí cơ bản của máy đếm khuẩn lạc tự động là máy đếm khuẩn lạc sẽ chụp một ảnh của đĩa [petri hoặc đĩa compact dry], ứng dụng sau đó sẽ sử dụng một thuật toán để tách và đếm các khuẩn lạc có trên đĩa. Thuật toán cũng có thể gặp có khăn trong việc phân biệt các khuẩn lạc khi có quá nhiều khuẩn lạc chồng lấn. Trường hợp này cần môt ứng dụng có khả năng phân tích hiệu quả và mạnh mẽ. Đây cũng là thách thức của các chuyên gia trong việc phát triển ứng dụng này.

Nhằm giảm bớt thời gian và sai số khi đọc kết quả thủ công. Cùng với giải pháp đĩa môi trường chuẩn bị sẵn CompactDry™. Hãng Nissui đã phát triển ứng dụng bactLAB đếm khuẩn lạc trên smart phone đơn giản và hiệu quả. 
Đây là phần mềm ứng dụng thay thế cho các máy đếm khuẩn lạc cồng kềnh trước đây. Bạn chỉ cần tải ứng dụng này trên CH PLay [trên hệ điều hành Android] hoặc hệ điều hành iOS của Apple với từ khóa "@bactlab. Tạo tài khoản trên ứng dụng bactLAB đơn giản bằng email và sử dụng.

Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi khuẩn ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.

Bạn đang xem: Khuẩn lạc

Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn.

Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc sẽ mang tính đặc trưng của từng loại vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc chẩn đoán vi khuẩn học. Các nhà nghiên cứu vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc.

Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.

Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy

2.1 Dạng mẫu nuôi cấy

Dạng dịch mẫu chỉ định nuôi cấy vi khuẩn đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích.Dạng trên bề mặt của môi trường rắn chứa thạch [từ 1,5-2%] trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm [0,5-0,7%].

2.2 Dụng cụ cấy

Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.Que cấy móc: Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.Que cấy vòng: Là que cấy kim loại đầu có vòng tròn, dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.Que cấy trang: Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.Ống hút thủy tinh: Dùng để chuyển một lượng vi khuẩn cần thiết lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng.Đầu tăm bông vô trùng: Dùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn.

3. Các phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn

3.1. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri

Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn phân lập.Ria các đường trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo.Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm.

3.2. Kỹ thuật cấy trang

Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trong đĩa petri.Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Sau đó, để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.Mở đĩa petri, nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Quá trình thực hiện hãy xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa để tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.

3.3. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa rồi hơ nhẹ phần cán, rồi cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Dùng ngón út của tay phải để mở nút bông. Sau khi mở nút bông, xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm và làm nguội que cấy [áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội]. Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống để thu sinh khối. Hơ nóng miệng ống nghiệm và đậy nút bông rồi đặt ống nghiệm vào giá đỡ.Đầu que nuôi cấy vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới rồi mở nút bông và khử trùng miệng ống nghiệm. Tiếp đó, đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.Nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.

3.4. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng

Phương pháp này tiến hành tương tự như trên, nhưng có một số khác biệt sau:

Cấy giống lên trên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống.Sau đó, cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên mặt thạch nghiêng.

3.5. Cấy giống từ môi trường lỏng bằng pipet đầu rời

Pipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ. Trong thao tác vô trùng, pipet đầu rời rất hữu dụng vì nó cho phép cấy chuyển dễ dàng dịch vi khuẩn lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri để tạo khuẩn lạc rời hoặc vào ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường lỏng để nuôi tăng sinh. Trước khi sử dụng, kiểm nghiệm viên cần biết các yêu cầu cơ bản trong cách nuôi vi khuẩn với pipet đầu rời như sau:

Mỗi pipet đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định đó là: 0,1 ml, 1- 20ml, 20- 20ml, 0,2- 1 ml, 1-5 ml, 1- 10 ml. Nên chọn pipet đầu rời với giới hạn dung tích thích hợp cho phạm vi thao tác.Pipet đầu rời có hai nấc: Nấc 1 tương đương với dung tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch; nấc 2 [vượt quá nấc 1] dùng để bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipet đầu rời.Khi sử dụng pipet đầu rời để cấy chuyển dịch giống thì cần phải tiến hành trong không gian vô trùng của ngọn lửa trong tủ cấy.Tay phải cầm pipet đầu rời, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Sau đó, cắm đầu pipet vào đầu tip.Dùng tay trái giữ ống nghiệm và bình chứa dịch giống vi sinh vật. Dùng ngón út, áp út của tay phải đang giữ pipet để kẹp giữ và mở nút bông, sau đó hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống rồi hút lấy dung tích cần thiết. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út tay phải.Đầu tip có chứa vi sinh vật cần được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.Dùng tay trái lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.Đưa đầu tip vào bên trong môi trường rồi bơm dịch giống vào môi trường. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình và đậy nút bông.Đầu pipet đầu rời và đầu tip được chế tạo bằng polymer cần phải khử trùng tuyệt đối đầu pipet và đầu tip bằng ngọn lửa.

Để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn, sau khi nuôi cấy vi khuẩn xong phải quan tâm đến các điều kiện môi trường nuôi vi khuẩn như: Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ; độ ẩm trong quá trình nuôi ủ cần đảm bảo đủ lượng nước; khí oxy đối với vi sinh vật hiếu khí, lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào.

Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec là một trong những bệnh viện không những đảm bảo chất lượng chuyên môn với đội ngũ y bác sĩ đầu ngành, hệ thống trang thiết bị công nghệ hiện đại mà còn nổi bật với dịch vụ khám, tư vấn và chữa bệnh toàn diện, chuyên nghiệp; không gian khám chữa bệnh văn minh, lịch sự, an toàn và tiệt trùng tối đa.

Xem thêm: Wft Trong Chứng Khoán Là Gì Mới Nhất 2022, Kiến Thức Cơ Bản

Để được tư vấn trực tiếp, Quý Khách vui lòng bấm số HOTLINE hoặc đăng ký trực tuyến TẠI ĐÂY.

366.3K

Chủ đề: Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri Chẩn đoán vi khuẩn học Cách nuôi vi khuẩn Chỉ định nuôi cấy vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn