Nguyên lý đo quang
Các thiết bị xét nghiệm sinh hóa là một dạng của máy quang phổ chuyên dùng cho nghành y, máy quang phổ được chế tạo từ những năm đầu thế kỷ 19 dựa trên định luật hấp thụ Bouger Lambert Beer.
Cường độ chùm sáng đơn sắc khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ tỉ lệ nghịch với chiều dày của lớp dung dịch nó đi qua
Sự giảm cường độ ánh sáng khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các tiểu phân tử vật chất hấp thụ mà ánh sáng gặp phải trên đường đi, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch chất hấp thụ
Như ta biết mật độ quang D, tỉ lệ với nồng độ C của dung dịch theo biểu thức:
D=ep. C. L
D: mật độ quang học của dung dịch [ chính là hiệu của cường độ tia ló với cường độ tia tới khi đi qua dung dịch]
ep: Hệ số tắt của dung dịch
C: Nồng độ dung dịch
L: Chiều dày lớp dung dịch mà chùm tia sáng đi qua
Trong các tham số trên, hệ số tắt ep là không đổi, chiều dày lớp dung dịch L cũng không đổi, bản chất dung dịch và bước sóng không đổi, nên mật độ quang D chỉ còn phụ thuộc vào nồng độ dung dịch C
Định luật Bouger-Lambert-Beer khá chính xác với các nồng độ thấp, do đó trong trường hợp dung dịch loãng ta có thể ứng dụng tốt định luật để tính nồng độ dung dịch. Đôi với các dung dịch đạm đặc, định luật không còn chính xác nữa, khi đó D không còn tuyến tính với C nữa [mặc dù cố định]. Khi đó, ta thường dùng phương pháp pha loãng dung dịch này sao cho nồng độ giảm xuống khoảng tuyến tính của hàm, đo như bình thường để xác định nồng độ dung dịch được pha loãng, từ đó tính toán ngược lại thu được nồng độ dung dịch ban đầu.
Từ hàm trên có thể coi : C = D x K [factor]
Để tính K, người ta sử dụng mẫu chuẩn std ,có nồng độ Cstd xác định trước, đo mật độ quang Dstd để tính K, theo đó:
Csample = Dsample x K = Dsample x [Cstd / Dstd]
Các phép đo quang
Phép đo điểm cuối [Endpoint]
Là phép đo mật độ quang D của dung dịch chất thử mà trong quá trình thực hiện phản ứng xảy ra hoàn toàn sau một thời gian nhất định. Tại thời điểm đó phản ứng kết thúc và tạo ra phức hợp màu đặc trưng và bền vững.
Sau khi ủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn, đo mật độ quang D của bệnh phẩm, từ đó tính được nồng độ của bệnh phẩm
Csample = Dsample x K = Dsample x [Cstd / Dstd]
Trong hóa sinh lâm sàng, tất cả các xét nghiệm có phản ứng tạo mẫu đặc trưng, việc chọn bước sóng [kính lọc ] phù hợp là việc làm bắt buộc. Hiện nay, hầu hết các xét nghiệm hóa sinh hiện đại, người ta sử dụng các loại thuốc thử với chế phẩm enzym, sản phẩm của phản ứng mầu thường được thể hiện dưới dạng mầu hồng cánh sen, thích hợp cho việc chọn kính lọc có bước sóng 500 - 546 nm, hoặc dưới dạng phức hợp mầu xanh lục thích hợp cho việc lựa chọn kính lọc có bước sóng 578 - 620 nm.
Riêng kỹ thuật xét nghiệm Bilirubin toàn phần và Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh là xét nghiệm sử dụng phép đo điểm cuối nhưng phải dùng “trắng“ bệnh phẩm [End point with sample blank]
Sở dĩ là như vậy vì bản chất huyết thanh nhiều Bilirubin có mầu vàng, làm thay đổi mật độ quang dung dịch. Mỗi người bệnh có nồng độ Bilirubin khác nhau, nên mỗi bệnh nhân khi làm xét nghiệm Bilirubin máu, đều kèm theo việc xác định MĐQ trắng của bệnh phẩm [Sample blank].
Phép đo Endpoint được sử dụng cho hầu hết các xét nghiệm sinh hóa máu:định lượng Glucose, protein, Albumin, Cholesterol, Triglycerid, HDL_c, LDL_c, Ure [ so màu ], Bilirubin
Phép đo động học 2 điểm [ Two point kinetic - Fix time]
Phép đo này sử dụng cho các xét nghiệm hóa sinh có phản ứng xảy ra không hoàn toàn sau một thời gian nhất định. Không thể xác định điểm kết thúc của phản ứng
Tại thời điểm t1, đo mật độ quang D1
Tại thời điểm t2, đo mật độ quang D2
Hiệu số mật độ quang deltaD=D2-D1
Nồng độ bệnh phẩm Csample = deltaD x K = deltaD x [Cstd / Dstd]
Phép đo động học 2 điểm thường được sử dụng để tính toán nồng độ Urea và Creatinin máu
Phép đo động học Enzyme [ Enzyme Kinetic]
Phép đo này sử dụng cho các xét nghiệm hóa sinh tìm hoạt độ các enzym trong huyết thanh.Phản ứng enzym thường không tạo phức hợp mầu mà làm thay đổi độ đục của dung dịch phản ứng trong khoảng thời gian nhất định. Việc xác định hoạt độ của enzym không thể xác định bằng phép đo điểm cuối mà phải sử dụng phép đo động học ở nhiều thời điểm [ t1, t2, t3, ..., tn ], thông thường đo ở 5 thời điểm t1 = 30s, t2 = 45s, t3 = 60s, t4 = 75s, t5 = 90s
deltaD1= D2-D1
deltaD2= D3-D2
deltaD3= D4-D3
deltaD4= D5-D4
deltaD=[ deltaD1+deltaD2+deltaD3+deltaD4]/4
Hoạt độ enzyme: U/L= deltaD x K [factor do nhà sản xuất cung cấp]
Phép đo động học Kinetic thường được sử dụng cho các xét nghiệm: GOT,GPT,Amylase,CK,CkMb
Các nội dung đã giải đáp
- Trong phân tích trắc quang [đổi với phân tích hàm lượng Fe], vì sao phải pha dung dịch chuẩn theo thứ tự mẫu - NH2OH - đệm pH - thuốc thử? [Như Oanh]
Trả lời: [H.Quang - phụ trách phần Trắc quang]
- Thứ tự thêm lần lượt các tác chất và thuốc thử như trong bài là nhằm đảm bảo chất phân tích tồn tại ở đúng dạng yêu cầu để tạo phức có màu [hay còn gọi là "lên màu"]. Ví dụ như trong bài này Fe3+ [dạng tạo phức không màu với 1,10-phenantrolin] cần được chuyển thành Fe2+ khi lên màu xác định hàm lượng Fe tổng trong dung dịch.
- Do đó đối với một số quy trình trắc quang thứ tự thêm tác chất ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ hình thành phức có màu đo được của chất phân tích. Trong bài thuốc thử là chất được đề nghị thêm vào cuối cùng, để đảm bảo Fe3+ được chuyển hết về Fe2+ [trong khoảng 30 phút], trước khi lên màu hàng loạt với 1,10-phenantrolin.
2. Trong bài phân tích bằng sắc ký khí, tại sao nhiệt độ đầu dò luôn phải lớn hơn hoặc bằng nhiệt độ cuối cùng của cột?
Trả lời: [H.Phú - phụ trách phần Sắc ký]
- Đặt nhiệt độ đầu dò thường phải ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng nhiệt độ cuối của chương trình nhiệt để tránh hiện tượng ngưng tụ của chất phân tích tại đầu dò.
3. Trong phân tích trắc quang, tại sao phải sử dụng mẫu trắng?
Trả lời: [H.Quang - phụ trách phần Trắc quang]
- Mẫu trắng [blank] dùng để đánh giá [có hay không] sự lên màu của các tác chất và thuốc thử. Do trong tác chất hoặc thuốc thử không hẳn là tinh khiết mà có thể còn lẫn tạp chất chứa chất phân tích.
- Nếu được sử dụng làm dung dịch so sánh trong quá trình auto-zero, tín hiệu của mẫu trắng bị triệt tiêu về 0.000 do đó tín hiệu đo được khi đo chuẩn hoặc mẫu là hoàn toàn của lượng chất phân tích trong chuẩn và mẫu tương ứng.
- Nếu auto-zero bằng nước cất và đo mẫu trắng, tín hiệu của mẫu trắng tương ứng cho ta biết lượng chất phân tích là tạp chất trong thuốc thử và tác chất, do đó khi dựng đường chuẩn ta phải trừ tín hiệu chuẩn cho tín hiệu mẫu trắng.
4. Trong chuẩn độ điện thế việc thêm Ba[NO3]2 ngoài việc nhằm tránh hiện tượng trôi thế thì còn có tác dụng gì khác?
Trả lời: [T. Thiện - phụ trách phần Điện hoá]
Dùng Ba[NO3] ngoài việc tránh trôi thế, còn giúp tránh hiện tượng hạt keo hấp thụ ion đang xem xét lên bề mặt, làm kết quả kém chính xác. Ngoài ra, Ba[NO3]2 còn giúp ổn định lực điện li trong dung dịch [vì khi diễn ra phản ứng kết tủa, lực ion trong dụng dịch thay đổi, làm giảm lực ion, phương trình Nerst dựa trên hoạt độ để tính toán, do đó, lực ion thay đổi sẽ làm thay đổi bản chất của dung dịch trong suốt quá trình chuẩn độ]
5. Mục đích sử dụng cá từ ngoài việc nhằm tránh kết tủa vón cục lại và bám lên điện cực thì còn có tác dụng gì khác?
Trả lời: [T. Thiện - phụ trách phần Điện hoá]
Cá từ được sử dụng ngoài mục đích trên, còn có mục đích khác là giúp hòa trộn dụng dịch tốt hơn, làm cho ion phân bố mọi nơi trong dụch dịch là như nhau. Vì phương pháp điện hóa này ta xác định được phụ thuộc vào sự biến đổi thế của dung dịch. Nếu dung dịch không đồng nhất, thì sự biến đổi thế đó là tại một điểm, hay toàn bộ dung dịch.
6. Trong bài cân, tại sao phải cân lặp 11 lần?
Trả lời: [C. Hậu - phụ trách phần Đo lường]
Trong bài cân, việc lặp lại nhiều lần [>11 lần] nhằm đánh giá sự ổn định của thiết bị. Sinh viên có thể làm lặp nhiều hơn 11 lần, nhưng 11 lần thường là số lần làm lặp tối thiểu để đánh giá khách quan 1 thiết bị theo thống kê.
Làm lặp càng nhiều lần, khoảng tin cậy của kết quả trung bình ngày càng thu hẹp [kết quả tiến dần về tuân theo phân phối Gauss].
7. Trong bài điện hóa, cho khoảng 2g Ba[NO3]2 ,ta có thể cho nhiều hơn 2g hay ít hơn không? Nếu cho quá nhiều hay quá ít thì sẽ ảnh hưởng như thế nào đến việc chuẩn độ.
Trả lời: [T. Thiện - phụ trách phần Điện hoá]
Dùng lượng khoảng 2g là không cần chính xác. Vì dùng khoảng khối lượng này đã đảm bảo cấu tử là áp đảo trong dung dịch, làm ổn định lực ion và cạnh tranh hấp thụ lên hạt keo. Nếu dùng lượng quá ít thì sẽ ko thể hiện được vai trò của Ba[NO3]2 trong dung dịch, còn nếu dùng quá nhiều thì sẽ gây hao phí hóa chất một cách không cần thiết.
8. Trong bài phân tích trắc quang, tại sao không đo trực tiếp mà phải lên màu với 1,10- phenantrolin?
Trả lời: [H.Quang - phụ trách phần Trắc quang]
Các muối của sắt như muối sắt [II] hoặc [III] với Chloride, nitrate, sulfate có thể tạo dung dịch có màu, tuy nhiên màu tạo thành có hệ số hấp thu quang [epsilon] rất bé nên thường rất khó để đo ở nồng độ thấp [đến tầm ppm] như trong bài.
Ngoài ra việc lên màu với 1,10-phenantrolin giúp quá trình đo có độ chọn lọc rất cao [do 1,10-phenantrolin chỉ lên màu với Fe[II] và hầu như không tạo phức có màu với các ion nào khác].
9. Trong bài phổ nguyên tử, khi đo Mn ở những nồng độ lớn thì độ hấp thu không còn tuân theo Định luật Lambert-Beer nữa. Vậy làm sao để ta xác định nồng độ chính xác của Mn trong khoảng nồng độ lớn đó?
Trả lời: [C. Hậu - phụ trách phần Phổ nguyên tử]
Đối với các mẫu có nồng độ lớn vượt ra ngoài khoảng tuyến tính [đối với bước sóng nhạy nhất], để đo các mẫu đấy ta có thể:
- Đơn giản nhất là đem mẫu đó đi pha loãng đến nồng độ phù hợp để nồng độ mẫu rơi vào khoảng tuyến tính.
- Sử dụng bước sóng kém nhạy hơn để thu được khoảng tuyến tính dài hơn [ta chấp nhận giảm độ nhạy để "đỡ công" đi pha loãng mẫu]; điển hình trong bài thực tập, có thể sử dụng bước sóng kém nhạy hơn là 280.1 nm thay vì sử dụng bước sóng nhạy nhất là 279.5 nm [số liệu cụ thể đã làm thực nghiệm rồi].
- Sử dụng đường chuẩn phi tuyến theo ISO 8466 - 2 [nếu có hiểu biết về Tiêu chuẩn này].
10. Trong bài 1, tại sao hiệu chuẩn pipet lại thường mắc sai số âm?
Trả lời: [C. Hậu - phụ trách phần Đo lường]
Trong bài 1, cần lưu ý có 6 thí nghiệm tổng cộng: ba thí nghiệm đầu [1,2 và 3] liên quan đến "cân" và ba thí nghiệm còn lại [4, 5 và 6] mới là thí nghiệm về hiệu chuẩn dụng cụ => đánh giá về độ đúng [trueness]. Như vậy, kết quả hiệu chuẩn dụng cụ ngoài phụ thuộc vào bản thân của dụng cụ đó [sai thật: bảo quản bị hư, sản xuất lỗi,...] thì kết quả này phụ thuộc nhiều vào "tay nghề" người làm.
Biểu hiện, 4 nhóm sẽ cho bốn kết quả hiệu chuẩn khác nhau mặc dù đều cùng thực hiện hiệu chuẩn trên cùng một dụng cụ. Như vậy, kết quả hiệu chuẩn pipette bị mắc số âm nếu bỏ qua yếu tố bản thân của pipette, thì kết quả đó do tay nghề ngươi làm:
- "Làm sạch" pipette đúng cách chưa.
- Thao tác sử dụng pipette có đúng không: có đảm bảo lượng chất lỏng bên trong chảy theo trọng lực, có để đầu pipette chạm vào "thành" đúng thời gian theo nhà sản xuất chưa.
- Tay nghề người làm "chuẩn" không.
11. Khoảng bất ổn của phép đo luôn do 3 yếu tố: thiết bị, đối tượng đo, người thực hiện. Vậy làm sao để suy ra khoảng bất ổn do tay nghề của người làm?
Khoảng bất ổn bao gồm phần đóng góp của thiết bị, đối tượng đo và người làm [chưa nói đến các yếu tố ngẫu nhiên], có thể nói S^2 [Tổng] = S^2 [TB] + S^2 [Đối tượng] + S^2 [Người làm].
Tùy vào trường hợp cụ thể mà phần đóng góp nào trội hơn. Chẳng hạn, đối với ba thí nghiệm cân;
- Thí nghiệm 2: Thực hiện cân lặp 1 đối tượng nhiều lần [11 lần] nhằm mục đích đánh giá về thiết bị, như vậy bất ổn thu được chủ yếu đến từ bất ổn của TB;
- TN 3: cân lặp nhiều lần các đối tượng khác nhau nhằm đánh giá về đối tượng cân, như vậy bất ổn thu được chủ yếu đến từ vật [đối tượng] cân.
Bất ổn của người làm là yếu tố mà người ta có thể khắc phục được bằng cách sẽ làm cẩn thận hơn chứ không thể "định lượng" một cách tròn trình bằng số liệu vì uncertainty phản ánh tất cả các yếu tố diễn biến trong suốt quá trình làm thí nghiệm.