Kỹ thuật real time pcr là gì năm 2024

PCR là một kỹ thuật được nhắc đến nhiều gần đây trong xét nghiệm chẩn đoán y học, đặc biệt trong xét nghiệm chẩn đoán covid-19. Phương pháp xét nghiệm PCR sử dụng trong phòng thí nghiệm với mục đích để nhân bản hàng triệu bản sao của một đoạn DNA mục tiêu. Vậy nguyên tắc hoạt động chính của PCR là gì? Và ứng dụng chính của xét nghiệm PCR trong chẩn đoán y học gồm những gì?

PCR là gì?

là một kỹ thuật nhanh chóng và hiệu quả được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu có kích thước nhỏ tạo ra hàng triệu bản sao của DNA. Nói cách khác, PCR cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một chuỗi DNA cụ thể từ một mẫu nhỏ ban đầu hay thậm chí là một bản sao duy nhất.

PCR được xem là một quá trình quan trọng đối với một loạt các công nghệ di truyền trong nghiên cứu y học và sinh học. Đặc biệt trong các xét nghiệm sinh học phân tử, PCR là 1 quá trình không thể thiếu giúp con người nghiên cứu sâu vào phân tích vật liệu di truyền DNA/RNA.

Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện dựa trên nguyên tắc khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình luân nhiệt (có thể 20-40 chu kỳ) gồm 3 bước:

+ Biến tính (Denaturation 950C): tách rời DNA mạch đôi thành mạch đơn bằng nhiệt.

+ Bắt cặp (Annealing 400C – 700C) cho phép sự bắt cặp giữa mồi với khuôn mẫu DNA.

+ Kéo dài (Elongation 720C) mạch mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung nhờ DNA polymerase

Các thành phần cần thiết để thực hiện phản ứng khuếch đại

Khi thiết lập 1 phản ứng PCR, bất kể đối với mẫu DNA nào đều yêu cầu các thành phần sau:

– Khuôn DNA.

– Mồi (Primer): Là trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu 5’ hay đầu 3’ của đoạn DNA cần nhân bản sao. Mồi được dùng theo từng cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược tính theo chiều phiên mã. Mồi xuôi có trình tự nucleotide cùng chiều với sợi mang mã, mồi ngược có trình tự nucleotide bổ sung với sợi mang mã của đoạn DNA cần nhân bản sao.

– dNTP (deoxynucleotide triphosphate): dNTP là hỗn hợp gồm 4 thành phần cần cho sự tổng hợp DNA là dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

– DNA polymerase: enzym có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu với đặc điểm chịu nhiệt, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao của bước biến tính.

– Dung dịch đệm ( buffer): thành phần Tris-HCl pH 8,3 ; KCl, MgCl2 và Gelatin. Dung dịch đệm có vai trò trong việc tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP, kích hoạt vị trí hoạt động của DNA polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh mẽ đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR .

Một phản ứng PCR hoàn chỉnh có thể được thực hiện trong vài giờ, hoặc thậm chí ít hơn một giờ với một số máy tốc độ cao nhất định.

Sau khi phản ứng khuếch đại được hoàn thành trong máy luân nhiệt, một phương pháp gọi là điện di trên gel agarose có thể được sử dụng để kiểm tra số lượng và kích thước của các đoạn DNA được tạo ra.

Ứng dụng của PCR trong chẩn đoán y khoa?

Kỹ thuật xét nghiệm PCR là một công cụ chẩn đoán tuyệt vờicho phép con người nhân lên cả triệu đoạn DNA (RNA) trong thời gian rất ngắn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ứng dụng trong chẩn đoán y học bao gồm:

+ Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm trên người: Dựa trên cơ sở phát hiện vi khuẩn hoặc virus lây nhiễm như HIV, bệnh lao (TB), Viêm gan B (HBV), Viêm gan C (HCV) Ung thư cổ tử cung (HPV)…

+ Chẩn đoán các bệnh di truyền, Sửa đổi các đoạn DNA.

+ Phân tích pháp y: Xác định dấu vân tay di truyền, xét nghiệm DNA, quan hệ huyết thống, điều tra tội phạm..

+ Dòng hóa DNA: Cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các bản sao giống hệt nhau của một đoạn DNA, nghiên cứu sự biểu hiện gen

Ngoài lĩnh vực y học, phương pháp PCR còn được áp dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh trong đa dạng lĩnh vực khác bao gồm: Xác định bệnh trên người, thú y, thủy sản, vi sinh thực phẩm, định danh,..

Hiện nay, công ty TNHH GIẢI PHÁP Y SINH ABT là 1 doanh nghiệp hàng đầu áp dụng phương pháp PCR, Real-time PCR thành công trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh. Để biết thêm thông tin chi tiết về kỹ thuật xét nghiệm này, cũng như khám phá các bộ kit chẩn đoán của ABT trong Y học:

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kì, mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tính DNA khuôn để tách mạch đôi, bắt cặp giữa mồi và trình tự bổ sung trên khuôn DNA, kéo dài mồi và tổng hợp đoạn DNA bổ sung theo chiều 5’-3’. Sau khi kết thúc một chu kì, bắt đầu một chu kì mới bằng bước biến tính.

Bước 1

Biến tính bằng cách tăng nhiệt độ lên 94-96 °C để phá vỡ liên kết hydrogen nối 2 sợi DNA khuôn, tách chúng thành 2 mạch đơn của DNA khuôn.

Bước 2

Sau khi 2 mạch DNA tách khỏi nhau hoàn toàn, nhiệt độ được hạ thấp xuống để tiến hành bước gắn mồi, mồi sẽ gắn vào sợi DNA đơn và tổng hợp mạch bổ sung theo chiều 5’-3’. Nhiệt độ của giai đoạn gắn mồi chủ yếu phụ thuộc vào đoạn mồi được sử dụng, thông thường sẽ thấp hơn giai đoạn biến tính khoảng 50°C (45-60°C). Nếu có sai lệch về mặt nhiệt độ ở giai đoạn này sẽ dẫn đến việc mồi sẽ không gắn hoàn toàn vào sợi DNA khuôn, hoặc gắn một cách tùy tiện sẽ gây ra các đột biến điểm không mong muốn.

Bước 3

Bước này gọi là bước kéo dài. DNA polymerase gắn tiếp vào cạnh đoạn mồi và hoạt động dọc theo sợi DNA và tổng hợp đoạn bổ sung theo chiều 5’-3’. Nhiệt độ bước này phụ thuộc DNA polymerase. Thời gian sẽ phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài sợi DNA cần khuếch đại.

Trong vòng một giờ, sự khuếch đại có thể đạt đến 1 triệu lần, DNA được khuếch đại có thể phát hiện bằng các phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp thường gặp nhất là điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethydium bromide. Hiện nay, để đạt được độ chính xác cao về định tính và cả định lường đồng thời tiết kiệm thời gian thao tác, người ta có thể sử dụng các thiết bị hiện đại thay thế như máy Realtime PCR.

Chắc hẳn các bạn đã hiểu rõ PCR là gì qua phần trình bày trên rồi. Bây giờ, mời các bạn tiếp tục tìm hiểu ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học .

2. Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học và các lĩnh vực liên quan.

Từ một lượng DNA rất nhỏ như: giọt máu, sợi tóc, hoặc tế bào,... thông qua kĩ thuật PCR người ta có thể khuếch đại chính xác và trật tự một lượng lớn DNA mục tiêu nhằm phục vụ cho mục đích thí nghiệm như lập bản đồ gen, phát hiện gen, phát hiện đột biến điểm, dòng hóa gen, giải mã trình tự DNA,...

Với những mục đích thí nghiệm kể trên, hiện nay PCR được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học: chuẩn đoán, tầm soát bệnh ung thư (phát hiện HPV trong ung thư cổ tử cung, tìm gen BRCA1-BRCA2 trong tầm soát ung thư vú, Phát hiện gan APC trong ung thư đại tràng,...), phát hiện hồng cầu hình lưỡi liềm bằng cách phát hiện đột biến điểm tại vị trí CvnI, nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen), phát hiện các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…), các virus (viêm gan B, viêm gan C, HIV, Herpes, H5N1, SARS,..).

Kỹ thuật PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: sử dụng nhiều cặp mồi VT1-F, VT1-R , VT2-F, VT2-R, eae-F, eae-R để phát hiện các gen VT1, VT2 và eae của vi khuẩn V erotoxigenic E.coli (VTEC) có khả năng sinh độc tố Verotoxin hoặc Shigalike toxin gây hại cho đường ruột. Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT (cholera toxin - độc tố ruột của vi khuẩn tả) giúp phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả.

3. Phát hiện lây nhiễm Covid 19 bằng xét nghiệm RT-PCR.

Đầu tiên, chúng ta cần nắm rõ khái niệm virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2. Viết tắt SARS-CoV-2, đây là một virus có hệ gen là một RNA sợi đơn. Sau khi thu dịch phết hầu họng của người nghi nhiễm. Kĩ thuật viên sẽ sử dụng một enzyme sao chép ngược là Reverse Trancriptase (RT) để biến đổi RNA của virus thành cDNA và tiến hành kỹ thuật PCR..

RT-PCR là gì

RT- PCR là gì? Đây là kỹ thuật Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction. RT- PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép đọc được tín hiệu trong mẫu (nếu có) theo thời gian thực (realtime). Kĩ thuật gồm 2 giai đoạn: (1) tổng hợp cDNA từ RNA virus bằng ezyme sao chép ngược, (2) khuếch đại cDNA bằng kĩ thuật PCR chính thống.

Nếu trong mẫu có RNA của virus thì sau một số chu kỳ khuếch đại nhất định. Tín hiệu trong mẫu sẽ vượt tín hiệu nền và được thiết bị Realtime PCR ghi nhận, gọi là CT (Cycle threshold) của mẫu. Giá trị CT thể hiện số chu kì mà virus SARS-CoV-2 bị phát hiện. Số chu kì chuẩn sẽ được cài đặt và được ghi lại tính hiệu trong suốt quá trình thiết bị Realtime PCR thực hiện xét nghiệm.

Ý nghĩa của CT trong kết quả test virus Sars-Cov2

Tải lượng virus, thể hiện qua chỉ số CT: khi mới nhiễm thì CT cao do lượng virus thấp. Sau đó CT giảm dần (lượng virus tăng mạnh). Tiếp theo đó, CT lại cao lên (lượng virus giảm xuống). Khi điều trị, bệnh nhân sẽ được xuất viện khi chỉ số CT>=30. Tức là người đó đã có tải lượng virus rất thấp, khó lây nhiễm cho người xung quanh. Khi chỉ số CT tiếp tục tăng đến trên 33 thì được xem là không thể lây được nữa. Tuy nhiên, tốc độ thải virus ở mỗi người bệnh mỗi khác nhau. Nên thời gian tải lượng virus thể hiện qua CT cũng khác nhau.

Xét nghiệm RT-PCR có thể phát hiện virus SARS-CoV-2 tại giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh (1-2 ngày trước khi có triệu chứng đầu tiên) và giai đoạn toàn phát bệnh. Do đó, xét nghiệm RT-PCR được xem là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán người mắc Covid-19.

Hy vọng những kiến thức trên đây đã góp phần giúp bạn có cái nhìn đầy đủ về PCR là gì cũng như RT PCR là gì. Đồng thời hiểu được ý nghĩa của "CT" trong kết quả xét nghiệm virus Sar-Cov-2.

Xét nghiệm PCR và RT

Về bản chất, PCR là định tính (chỉ cho biết có sợi ADN của virus hay không, không định lượng được virus; còn RT-PCR là bán định lượng, ngoài việc phát hiện sợi DNA, còn xác định tải lượng virus đang có trong cơ thể người bệnh, do đó RT-PCR ưu việt hơn.

RT Real.time PCR là gì?

Kỹ thuật xét nghiệm Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích. Xét nghiệm Realtime PCR trở nên hữu dụng để định danh và mô tả chính xác những tác nhân gây bệnh, có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh lây truyền qua đường tình dục.

Phương pháp real time PCR là gì?

Xét nghiệm giúp phát hiện 4 tác nhân gây bệnh qua đường tình dục phương pháp Real time PCR. Đây là phương pháp giúp phát hiện một lượng nhỏ ADN của tác nhân gây bệnh trong nước tiểu, dịch niệu đạo, dịch âm đạo… Để lại số điện thoại để nhận cuộc gọi tư vấn miễn phí!

Multiplex real time PCR là gì?

Multiplex real-time PCR là kỹ thuật nhân bản một hoặc nhiều trình tự DNA trong cùng một phản ứng PCR, nhiều trình tự sẽ được nhân bản sử dụng nhiều cặp mồi và các thành phần master mix.